Zellbasierte Expressionssysteme bei Säugetieren

Expressionssysteme auf der Basis von Säugetierzellen sind die am häufigsten verwendete Technik für die Herstellung von Biopharmazeutika. Diese Expressionssysteme funktionieren bemerkenswert gut in Bezug auf posttranslationale Modifikationen und die Proteinfaltung, die für die Aktivität und therapeutische Wirksamkeit rekombinanter Proteine entscheidend sind.

Um Ihnen die Entscheidung zu erleichtern, ob Säugetierexpressionssysteme die Antwort auf Ihre Probleme sind, haben wir wichtige Informationen über ihre Vorteile und Leitprinzipien zusammengestellt.

Was ist zellbasierte Expression bei Säugetieren?

Die Expressionsplattform, die die am besten organisierten und funktionellen Säugetierproteine hervorbringt, ist das Wirtssystem von Säugetieren. Die Expression in Säugetieren ist die Technik der Wahl, um die Funktion eines bestimmten Proteins in einem physiologisch relevanten Kontext zu untersuchen, da sie den größten Anteil an posttranslationaler Verarbeitung und funktioneller Aktivität des Proteins aufweist.

Mit diesem Ansatz werden therapeutische Proteine, Antikörper und Proteine in funktionellen zellbasierten Assays erzeugt.

Expressionssysteme für Säugetierzellen

Die ideale Methode zur Herstellung eukaryotischer Proteine sind Zellexpressionssysteme, vor allem wenn eine korrekte Faltung und posttranslationale Modifikationen (Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung usw.) erforderlich sind. Sie erzeugen rekombinante eukaryotische Proteine in ihrer reinen Form mit ihrer ursprünglichen Tertiärstruktur, ihren physikochemischen Eigenschaften und ihrer biologischen Aktivität.

Diese Technologie wurde zur Expression komplexer, veränderter, funktioneller Proteine und Antikörper sowie sekretierter oder Membranproteine wie rekombinante Glykoproteine (Enzyme und Impfstoffe), Hormone, monoklonale Antikörper und Zytokine eingesetzt. Säugetierzellen werden aus tierischem Gewebe entnommen oder isoliert.

Der endgültige Leitfaden für Expressionssysteme auf der Basis von Säugetierzellen

Tierische Zellen werden seit kurzem zur Herstellung von Viren, Virusuntereinheiten, Antikörpern, rekombinanten Proteinen und Vektoren für die Gentherapie genutzt. Säugetierzellsysteme werden nicht nur in der kommerziellen Biotechnologie eingesetzt, sondern auch zur Erforschung der wichtigsten Aspekte der posttranslationalen Proteinverarbeitung, der Transkription, der Translation und der Genreplikation verwendet.

Wesentliche Aspekte der Genaktivität von Säugetieren können heute dank der Verfügbarkeit von Zellen, die transformiert werden können, und auf Viren und Plasmiden basierenden Vektorsystemen für Säugetierzellen untersucht werden. Expressionssysteme für Säugetierzellen werden in der Regel für folgende Zwecke verwendet:

• Bestätigung eines Genprodukts aus einem Klon.
• Untersuchung, wie die Proteinexpression in Säugetierzellen die Zellphysiologie beeinflusst.
• Herstellung von cDNA-Bibliotheken und Isolierung von Genen.
• Sie stellen geeignete Proteine mit Faltung und Glykosylierung her, um biologische Aktivitäten sowohl in vitro als auch in vivo zu bewerten.
• Wir stellen genügend Proteine und Glykoproteine her, um den strukturellen Aufbau der Protein- und Nährstoffeinheiten zu charakterisieren.
• Die Produktion von therapeutischen Proteinen wie Interferon, Gewebeplasminogenaktivator, Erythropoietin und Faktor VIII sowie von therapeutisch wichtigen Antigenen auf der Oberfläche von Viren wie dem Oberflächenantigen des Perihepatitis-B-Virus ist ebenfalls von wesentlicher Bedeutung.
• Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist die Nummer sieben.

Säugetierzellen besitzen mehrere entscheidende Eigenschaften, wie die Fähigkeit, posttranslationale Veränderungen vorzunehmen und entsprechend gefaltete Glykoproteine mit terminaler Sialinsäure und komplexen antennären Oligosacchariden freizusetzen. Diese kovalenten Modifikationen können sich auf die therapeutische Wirksamkeit des Proteins auswirken (z. B. auf die Halbwertszeit im Blutkreislauf und die Biospezifität), oder sie können Merkmale liefern, die für die biochemische Charakterisierung hilfreich sind (z. B. strukturelle Stabilität, funktionelle Gruppen und biologische Rolle).

Durch die selektive Hemmung des Eintritts falsch gefalteter, falsch zusammengesetzter und unvollständig gebildeter Proteine in den sekretorischen Weg werden Säugetierproteine unter Qualitätskontrolle produziert. Das Material, das ausreichend verdaut wurde, wird weiterverarbeitet und normalerweise als voll funktionsfähiges Protein freigesetzt.

Die Fähigkeit von Säugetierzellen, Proteine mit Sialylglykoformen zu exprimieren, die den vom Menschen hergestellten Glykoproteinen sehr ähnlich sind, ist ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Fähigkeit. Im Gegensatz dazu erzeugen Hefen häufig eine Hyper-Mannose-Glykosylierung, und E. coli verfügt über keinerlei Glykosylierungsmechanismus.

Die Leber entfernt die von der Hefe erzeugten Glykoproteine schnell aus dem Blutkreislauf, was beim Menschen ebenfalls negative immunogene Reaktionen hervorrufen kann. Der korrekte Zusammenbau multimerer Proteine kann ebenfalls verändert werden, ebenso wie die Carboxylierung von Glutaminsäureresten, die Hydroxylierung von Asparagin- und Asparaginresten, die Sulfatierung von Tyrosinresten, die Phosphorylierung von Proteinen über die Zellrezeptor-Protein-Interaktion, die Acylierung von Fettsäuren und die Phosphorylierung von Proteinen.

Säugetierzellen führen posttranslationale Veränderungen wie Glykosylierung, Kohlenhydrattrimming und proteolytische Propeptidverarbeitung durch. In E. coli führt die Herstellung von rekombinanten Proteinen, die in den Zellen produziert werden, zum Aufbau der reduzierten Form des Proteins, häufig als refraktile unlösliche Aggregate, die im Gegensatz zu Säugetierzellen weiter denaturiert und erneut gefaltet werden müssen.

Wann sollte man sich für Expressionssysteme auf der Basis von Säugetierzellen entscheiden, um rekombinante Proteine zu exprimieren?

Die besten Expressionssysteme für große Proteine mit komplizierten nativen Strukturen und Aktivitäten sind jene, die auf Säugetierzellen basieren. Säugetierzellen sind den kleineren eukaryotischen oder bakteriellen Systemen überlegen:

• Faltung eines Proteins
• Veränderung nach der Übersetzung (wie beim Menschen)
• bieten unglaublich hohe Proteinausbeuten
• verfügen über sehr effektive Mechanismen zur Proteinsekretion, die eine kostengünstige und hochreine Proteinreinigung ermöglichen
• gewährleisten eine verbesserte Einheitlichkeit von Charge zu Charge bei gleichzeitiger Einhaltung der entscheidenden Qualitätsnormen für die Herstellung therapeutischer Proteine
• Ermöglicht unterschiedliche Zelllinien und Methoden (z. B. instabil versus transient)

Aufgrund dieser Eigenschaften werden derzeit für die Herstellung der meisten auf dem Markt erhältlichen therapeutischen Proteine ertragreiche Säugetierzelllinien wie CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) verwendet. Diese Zellen haben sich so entwickelt, dass sie in spezifischen chemischen Umgebungen ohne tierische Produkte gedeihen.

Außerdem bieten sie Kulturbedingungen mit hoher Dichte, die die Ausbeute erhöhen, während das Kulturvolumen gering bleibt. Säugetiersysteme produzieren eine große Anzahl von Proteinen außerhalb des medizinischen Bereichs. Die primären nicht-therapeutischen Anwendungen betreffen die strukturelle und funktionelle Analyse menschlicher oder tierischer Proteine, die für die Grundlagenforschung und die klinische Forschung unerlässlich sind.

Diese Systeme können auch Enzyme oder andere funktionelle Proteine für analytische und wissenschaftliche Zwecke herstellen. Darüber hinaus können Säugetierzellen diese Aufgabe übernehmen, wenn rekombinante Proteine aus Nicht-Säugetieren mit anderen Expressionsmethoden nicht hergestellt werden können.

Säugetierzellen als Wirt der Wahl

Obwohl viele Wirte von Säugetierzellen Proteine produzieren können, haben sich nur einige wenige als Optionen für die Herstellung von Proteinen durchgesetzt, die in klinischen Anwendungen eingesetzt werden. Die Notwendigkeit von Zelllinien, die:

• Kann kontinuierlich wachsen
• Möglichkeit des Suspensionswachstums (in Bioreaktoren)
• minimales Risiko einer zufälligen Infektion mit Viren, die schädlich sein könnten
• Sie haben genetische Stabilität
• Einfache Charakterisierung hinsichtlich der Isoenzyme, der Anzahl der Genkopien, der Morphologie und der Karyologie

Der potenzielle Nutzer muss eine Expressionsstrategie festlegen, die auf den Endzielen basiert, da es mehrere Wirtszellsysteme, verfügbare virale oder cDNA-basierte Vektoren und die Möglichkeit einer stabilen oder vorübergehenden Expression gibt.

Bei der vorübergehenden Expression kommt es in der Wirtszelle zu einer Spitze in der Proteinproduktion, auf die in der Regel eine schnelle Lyse und der Tod der Zelle folgen. Dadurch ergibt sich das Problem der Isolierung des gewünschten Proteins aus einem Gemisch von Nukleinsäuren, lysiertem Zellprotein und Viruspartikeln, das eine Konzentration von 5 g/ml haben kann.

Aufgrund des geringen Titers und der anfänglichen Reinheit kann die Produktausbeute bei der Reinigung minimal sein; wenn jedoch nur geringe Proteinmengen benötigt werden, ist das Vaccinia-System oder die transiente Expression in COS-Zellen eine schnelle und akzeptable Technologie. Da es schwierig ist, die transiente Expression in ein Bioreaktorsystem zu übertragen, müssen bei einer regulären Expression größere Proteinmengen produziert werden.

Einige wenige Zelllinien wurden bereits erfolgreich als Wirte für die Herstellung nützlicher Proteine und Viren eingesetzt. Dazu gehören die normale embryonale Zelllinie WI-38 und die menschliche embryonale Lungenzelllinie MRC-5. Diese Zellen haben eine auf ein halbes Jahrhundert begrenzte Lebenszeit, bevor sie zu altern beginnen und zugrunde gehen. Ihr Anheftungswachstum ist abhängig.

Zelllinien, die einer viralen Transformation oder Chromosomenmutation unterzogen wurden, können sowohl die Fähigkeit zu unbegrenztem Wachstum als auch die Fähigkeit zum Wachstum in Suspension besitzen. HeLa- und Namalwa-Zellen aus menschlichen Lymphomen bzw. Gebärmutterhalskrebs sind zwei Beispiele für solche Zelllinien. Die Möglichkeit, dass tumorerzeugende Agenzien auf das Endprodukt übertragen werden, hat zu einer gewissen Zurückhaltung bei der Verwendung dieser Zelllinien für die Entwicklung therapeutischer Arzneimittel geführt.

Zur Herstellung größerer Mengen rekombinanter Proteine ist eine stabile Expression erforderlich, die in der Regel in Myelomzellen (z. B. NS/O), Baby-Hamster-Nieren-Zellen (BHK-21) oder CHO-Zellen durchgeführt wird. Diese Zelllinien haben eine unendliche Kapazität für eine groß angelegte Expansion und sind gute Wirte für den stetigen Einbau heterologer DNA.

Vorübergehende oder stabile Ausprägung?

Ein Protein kann in zellbasierten Systemen von Säugetieren entweder vorübergehend oder dauerhaft exprimiert werden. Beide Strategien haben Vor- und Nachteile. Sie können daher in verschiedenen Phasen des Proteinsyntheseprozesses oder für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden.

Säugetierzellen können DNA-Vektoren nicht getrennt von ihrem Genom replizieren, da sie nicht in der Lage sind, die Replikationsursprünge von Plasmiden zu identifizieren, was für andere Expressionssysteme charakteristisch ist. Diese Einschränkung führte zur Schaffung von instabilen und transienten Systemen.

Die erste Art von Systemen macht sich die langen Zellzyklen von Säugetierorganismen zunutze, um die Expression rekombinanter Proteine in Säugetierzellen für kurze Zeit zu ermöglichen. Der Expressionsvektor wird in der Regel in großer Zahl in diese Systeme transfiziert, geht aber nach einigen Zellteilungen wieder verloren.

Einer der Hauptvorteile dieser Systeme sind die kurzen Durchlaufzeiten und die hohe Ausbeute. Aufgrund dieser Eigenschaften sind sie äußerst nützlich für Anwendungen wie das Screening von Medikamenten und Proteinvarianten sowie für die Forschung.

Wenn Sie einen Service für die Proteinexpression suchen, ist Biomatik hier, um Wissenschaft zugänglich und kostengünstig zu machen, indem wir hochwertige integrierte Produkte und Dienstleistungen für die biowissenschaftliche Forschung und Arzneimittelentwicklung anbieten. Biomatik unterstützt diejenigen, die Medikamente erforschen und entwickeln, von weit verbreiteten Bioreagenzien und ELISA-Kits bis hin zu spezialisierten Herstellungsdiensten, einschließlich Antikörper-Sequenzierungsdiensten, Gensynthese, Antikörperproduktion und Peptidsynthese.

Im Gegensatz dazu ist eine reguläre Expression ein langwieriges Verfahren, bei dem der DNA-Vektor dauerhaft in das Genom des Säugetiersystems eingebaut werden muss. Nach der Transfektion müssen einzelne positive Klone ausgewählt und isoliert werden, da diese Integration ortsgebunden oder zufällig sein kann. Die Phase, die am längsten dauert, das Einzelklon-Screening, kann in der Regel bis zu 4 Monate dauern.

Es wird häufig mit manuellen Techniken wie der reduzierenden Verdünnung oder automatisierten Verfahren wie VIPSTM (verified in-situ plate seeding) durchgeführt. Diese Technologie kann für die biopharmazeutische Produktion in großem Maßstab eingesetzt werden, da es Zeit braucht, stabile Zelllinien zu erzeugen.

Anforderungen an das Expressionssystem für Säugetiere

Wie effektiv ein Gen transkribiert wird, hat einen entscheidenden Einfluss darauf, wie stark es exprimiert wird. Jedes Gen kann transkribiert werden, wenn der RNA-Polymerase-Komplex an die Promotorregionen bindet und sich von 5 nach 3 entlang des Gens fortbewegt. Dadurch entsteht ein RNA-Transkript, das sich schließlich am Transkriptionssignal vom Gen trennt und das Transkript in Vorbereitung auf eine eventuelle Translation einfriert.

Für die Genexpression in Säugetierzellen sind eine geeignete Zelllinie und die richtigen Vektoren erforderlich. Die Vektoren sollten dazu dienen, das gewünschte Gen in die erforderlichen Zelllinien zu bringen.

Zelllinien als Expressionssysteme

Aus Säugetierzellen hergestellte Proteintherapien haben in den letzten zehn Jahren das Gesicht der menschlichen Gesundheitsversorgung verändert. Die Bedeutung von Proteintherapien hat die Suche nach effizienteren und kostengünstigeren Zelllinien, die hochwertige Proteinprodukte herstellen können, vorangetrieben.

Virale Impfstoffe, diagnostische Tests und therapeutische Proteine wurden in der Vergangenheit mit Bioprozessen auf der Basis von Säugetierzellen hergestellt. Zellen dienen als Wirt für die Herstellung von Proteinen in Proteintherapien.

Vektoren

DNA-Moleküle, die sich unabhängig voneinander replizieren und als Vektoren fungieren, können fremde DNA-Fragmente transportieren. Es ist ein Werkzeug für das Klonen von Genen. Ein geeigneter Vektor wird zunächst verwendet, um die gewünschte DNA zu klonen. Anschließend kann das gewünschte Gen transfiziert und im Wirt exprimiert werden. Am häufigsten werden Vektoren aus Säugetierviren hergestellt, die heterologe Gene in Säugetierzellen exprimieren.

Dazu gehören Herpesviren, Polyomaviren, Papoviren und Simian Viruses 40 (SV40). Die Wahl eines wirksamen Promotors und eines Selektionsmarkers ist für die Konstruktion des Vektors erforderlich.

Unterm Strich

Auf Säugetierzellen basierende Expressionssysteme für rekombinante Proteine können eine geeignete Proteinfaltung und posttranslationale Modifikationen bewirken, die häufig für eine vollständige biologische Aktivität erforderlich sind. In erster Linie bietet der Artikel einen prägnanten Überblick über die jüngsten Entwicklungen bei Säugetier-Expressionssystemen, die für die Tierbiotechnologie von Bedeutung sind.

Mehr als die Hälfte der heute auf dem Markt befindlichen biopharmazeutischen Produkte und Hunderte weiterer Kandidaten in der klinischen Entwicklung werden durch die Expression von Säugetierproteinen hergestellt, die sich in den letzten zwei Jahrzehnten zur vorherrschenden Technik der rekombinanten Proteinproduktion für therapeutische Zwecke entwickelt hat.

Es wurden neue Strategien zur Genexpression, zum Gen-Silencing und zum Gen-Targeting eingeführt, und es wurden bedeutende Erfolge bei der Schaffung und Entwicklung neuer Zelllinien erzielt. Nur wenn die Produktivität, die Bioaktivität, die Funktion und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Zielproteins zusammen mit den Kosten, der Praktikabilität und der Sicherheit des Systems selbst berücksichtigt werden, kann die beste Expressionsmethode gewählt werden.

Die Suche nach weiteren Säugetierzelllinien, Vektorsystemen und Genexpressionstechnologien ist notwendig, um effektivere Proteine mit hoher biologischer Aktivität herzustellen.

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