Einblicke in die molekularen Mechanismen zur Steuerung der Nekroptose

Die Nekroptose, eine Form des regulierten Zelltods, hat in letzter Zeit aufgrund ihrer Beteiligung an verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen große Aufmerksamkeit erregt. Die Nekroptose ist eine spezielle Form des programmierten Zelltods, die durch verschiedene Signalwege, Mediatoren und Immunreaktionen streng kontrolliert wird. Die Signalwege Interferon-γ (IFN-γ) und Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) wurden als entscheidende Regulatoren der Nekroptose in Makrophagen identifiziert. Das Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, die die Nekroptose steuern, ist von entscheidender Bedeutung, um ihre Rolle bei der Immunantwort und der Pathogenese von Krankheiten zu entschlüsseln.

In diesem Whitepaper werden die neuesten Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen der Nekroptose im Zusammenhang mit rezeptor-interagierenden Proteinkinasen (RIPK) vorgestellt und Beispiele für den Kaninchen-Antikörper gegen RIPK3 (Cat #: 2283) von ProSci bei der Analyse der Expression von RIPK3 in verschiedenen Zelllinien mittels Western Blot gegeben.

ProSci verfügt über mehr als 25 Jahre Erfahrung in der Entwicklung von qualitativ hochwertigen rekombinanten, monoklonalen und polyklonalen Single-Domain-Antikörpern der variablen schweren Domäne der schweren Kette (VHH). Darüber hinaus bieten unsere kundenspezifischen Antikörperdienste die Flexibilität, die Entwicklung und Produktion von Antikörpern für nahezu jeden Bedarf anzupassen.

„RIPK3 und MLKL: Wesentliche Akteure bei IFN-γ-induzierter PS-Exposition und Nekroptose“

Die 2019 veröffentlichte Arbeit von Chen et al. mit dem Titel „Interferon induces the cell surface exposure of phosphatidylserine (PS) by activating the protein MLKL in the absence of caspase-8 activity“ präsentiert Forschungsergebnisse über die Rolle von RIPK3 bei der IFN-γ-induzierten PS-Exposition in embryonalen Fibroblasten der Maus (MEFs). Die Autoren zeigten, dass RIPK3 für die PS-Exposition in MEFs notwendig ist. Gleichzeitig ist die RIPK3-aktivierte Oligomerisierung des MLKL-Proteins (mixed lineage kinase domain-like protein) wesentlich für die IFN-γ-induzierte PS-Exposition und die Durchführung des nekroptotischen Zelltods in MEFs (1).

Die Nekroptose ist eine nicht-apoptotische, regulierte Form der Nekrose, die durch Auslöser wie den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ausgelöst wird, der an seine Rezeptoren bindet (2). Sie erfordert die Aktivität von RIPK1 und RIPK3 und wird durch die Aktivierung von MLKL vermittelt. (3) Interferon (IFN) wird in zwei Gruppen eingeteilt, Typ I und Typ II, und beide Arten von IFN induzieren die Expression von Hunderten von spezifischen Genen (4,5).

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RIPK3 für die IFN-γ-induzierte PS-Exposition und Nekroptose in RIPK3-rekonstituierten iC8KO MEFs, immortalisierten Caspase-8-Knockout (iC8KO)-Mausembryonalfibroblasten mit exogen exprimiertem RIPK3, notwendig ist und dass MLKL in IFN-γ-behandelten MEFs vor der Nekroptose phosphoryliert und oligomerisiert wird. Darüber hinaus hängen die IFN-γ-induzierte PS-Exposition und Nekroptose in verschiedenen Zellen von RIPK1, RIPK3 und MLKL ab.

Diese Forschung unterstreicht die Rolle von RIPK3, MLKL und IFN-γ bei der Auslösung von PS-Exposition und Nekroptose in MEFs und bietet Einblicke in die Mechanismen, die der IFN-γ-induzierten PS-Exposition zugrunde liegen, sowie in die möglichen Funktionen von MLKL in diesem Prozess. Unterstützt durch den Einsatz des Kaninchen-Antikörpers gegen RIPK3 von ProSci könnten diese Erkenntnisse zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für die gezielte Bekämpfung der Nekroptose bei Krankheiten wie Krebs und Infektionen führen.

„Auswirkungen der RIPK1 K45A-Mutation auf Nekroptose, Zytokinsignalisierung und Immunantwort: Eine veränderte Landschaft der Entzündungs- und Infektionsanfälligkeit“

Die 2016 von Shutinoski et al. veröffentlichte Arbeit mit dem Titel „K45A mutation of RIPK1 results in poor necroptosis and cytokine signaling in macrophages, which impacts inflammatory responses in vivo“ untersuchte die Rolle der Kinase-Domäne von RIPK1 bei der Nekroptose und Zytokin-Signalisierung in Makrophagen und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Entzündungsreaktion in vivo. Außerdem wurde die Wirkung einer K45A-Mutation von RIPK1 auf die Nekroptose von Makrophagen und die Aktivierung der Entzündungsreaktion untersucht (7).

RIPK1 ist für die Induktion der Nekroptose unerlässlich und wird durch die Aktivierung verschiedener Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und Zytokinrezeptoren ausgelöst (8,9). Die Phosphorylierung von RIPK1 führt zur Interaktion von RIPK1 und RIPK3, die für die Nekroptose notwendig ist (10). RIPK3 kann in bestimmten Fällen die Nekroptose auch unabhängig von RIPK1 auslösen (11). Darüber hinaus ist auch das MLKL-Protein für die Nekroptose unerlässlich, da seine Phosphorylierung zu seiner Oligomerisierung und Verlagerung zur Zellmembran führt, wodurch die zelluläre Integrität gestört wird (12). Somit spielen die Proteine RIPK1 und MLKL durch ihre jeweiligen Interaktionen und Phosphorylierungen eine wichtige Rolle bei der Auslösung der Nekroptose.

In ihrer Studie verwendeten die Autoren den RIPK1^K45A-Mäusestamm, um die entscheidende Rolle der RIPK1-Kinase-Aktivität bei der Erleichterung der Makrophagen-Nekroptose zu klären. Bei ihren Untersuchungen stellten sie fest, dass die RIPK1^K45A-Mutation zu einem Rückgang der Zytokinproduktion, einer Verringerung der Phosphorylierung von RIPK1- und MLKL-Proteinen und einer Erhöhung der Zellüberlebensrate nach Behandlungen mit einer Kombination aus Lipopolysaccharid (LPS) und einem zellpermeablen Pan-Caspase-Inhibitor (zVAD) sowie Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNFα) und zVAD führte. Die LPS/zVAD-Behandlung wurde eingesetzt, um Nekroptose in Makrophagen auszulösen, wobei die Makrophagen LPS zusammen mit zVAD ausgesetzt wurden. Bei der TNFα/zVAD-Behandlung wurde TNFα, ein Entzündungszytokin, in Verbindung mit zVAD verabreicht, um die Nekroptose in Makrophagen auszulösen.

Darüber hinaus entdeckten die Forscher den regulierenden Einfluss von RIPK1 auf die TNFα-Signalgebung und seine Beteiligung an der Transkriptionsregulation von Makrophagen-Entzündungsprotein-1 alpha (MIP-1α) und Interleukin-1 alpha (IL-1α). Darüber hinaus machten die Forscher die faszinierende Beobachtung, dass Caspase-8-Inhibitoren das Auftreten von Nekroptose in Makrophagen verstärkten, insbesondere wenn der p38MAPK-Signalweg unterdrückt wurde.

Diese Studie zeigte, dass Lysin-45 von RIPK1 für die Auto-Phosphorylierung von RIPK1 und den Zelltod von Makrophagen erforderlich ist, der durch verschiedene Stimuli, einschließlich LPS und TNF-α, ausgelöst wird. RIPK1K45A-Makrophagen waren resistent gegen den durch diese Stimuli ausgelösten Zelltod und zeigten eine verminderte Phosphorylierung von STAT1 als Reaktion auf LPS/ZVAD- und TNF-α/ZVAD-Behandlungen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass RIPK1K45A an der Regulierung des Zelltods nach der TNF-R-Bindung beteiligt ist und eine Rolle bei der Verhinderung eines übermäßigen Zelltods als Reaktion auf verschiedene Stimuli spielt.

Die Studie zeigte, dass die Phosphorylierung von RIPK3 in RIPK1K45A-Makrophagen abgeschwächt war, was auf die wichtige Rolle dieser Kinasedomäne bei der Förderung der Makrophagen-Nekroptose hinweist. Der RIPK3-Antikörper wurde zur Identifizierung und Messung des RIPK3-Spiegels sowie seiner Interaktion mit RIPK1 und MLKL mittels Western Blot verwendet. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der RIPK3-Antikörper für die Charakterisierung der RIPK1-Kinase-Aktivität und ihrer Rolle bei der Regulierung der Nekroptose, der Entzündungsreaktion und der Zytokin-Signalgebung in Makrophagen von wesentlicher Bedeutung war.

Schlussfolgerung

Diese Untersuchungen geben wichtige Einblicke in die Rolle von RIPK3, MLKL und IFN-γ bei der Initiierung der Phosphatidylserin-Präsentation und Nekroptose in embryonalen Fibroblasten der Maus (MEFs). Darüber hinaus unterstreicht sie die entscheidende Rolle von RIPK3 und MLKL bei der IFN-γ-vermittelten Phosphatidylserin-Präsentation und dem Nekroptose-Signalweg.

Darüber hinaus behindert eine Mutation in RIPK1, insbesondere RIPK1K45A, die Nekroptose von Makrophagen und die Auslösung der Entzündungsreaktion. Diese Forschungsarbeit unterstreicht die Rolle der RIPK1-Kinase-Domäne bei der Initiierung der Nekroptose und der Zytokin-Signalisierung in Makrophagen und die anschließenden Auswirkungen auf die Entzündungsreaktion in vivo.

Der ProSci-Kaninchen-Antikörper gegen RIPK3 wurde in dieser Untersuchung eingesetzt, um die Expression von RIPK3 in verschiedenen Zelllinien zu untersuchen. Er spielt eine entscheidende Rolle bei der Beschreibung der RIPK1-Kinase-Aktivität und ihrer regulatorischen Funktionen bei Nekroptose, Entzündungsreaktionen und Zytokin-Signalen in Makrophagen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen haben das Potenzial, weitere Studien zu den Funktionen von RIPK3 und MLKL im Prozess der Phosphatidylserin-Exposition und der Nekroptose zu erleichtern und damit unser Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen des Zelltods im Immunsystem voranzutreiben, was zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur gezielten Bekämpfung der Nekroptose bei Krankheiten wie Krebs und Infektionen führt.

Quellen

1. Chen J, Kuroki S, Someda M, Yonehara S. Interferon-γ induces the cell surface exposure of phosphatidylserine by activating the protein MLKL in the absence of caspase-8 activity. J Biol Chem. 2019 Aug 9;294(32):11994-12006. doi: 10.1074/jbc.RA118.007161. Epub 2019 Jun 19. PMID: 31217278; PMCID: PMC6690710. 
2. Dondelinger Y, Hulpiau P, Saeys Y, Bertrand MJM, Vandenabeele P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends Cell Biol. 2016 Oct;26(10):721-732. doi: 10.1016/j.tcb.2016.06.004. Epub 2016 Jun 28. PMID: 27368376. 
3. Cho YS, Challa S, Moquin D, Genga R, Ray TD, Guildford M, Chan FK. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 2009 Jun 12;137(6):1112-23. doi: 10.1016/j.cell.2009.05.037. PMID: 19524513; PMCID: PMC2727676. 
4. Pestka S, Krause CD, Walter MR. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev. 2004 Dec;202:8-32. doi: 10.1111/j.0105-2896.2004.00204.x. PMID: 15546383. 
5. Borden EC, Sen GC, Uze G, Silverman RH, Ransohoff RM, Foster GR, Stark GR. Interferons at age 50: past, current and future impact on biomedicine. Nat Rev Drug Discov. 2007 Dec;6(12):975-90. doi: 10.1038/nrd2422. PMID: 18049472; PMCID: PMC7097588. 
6. Zargarian S, Shlomovitz I, Erlich Z, Hourizadeh A, Ofir-Birin Y, Croker BA, Regev-Rudzki N, Edry-Botzer L, Gerlic M. Phosphatidylserine externalization, “necroptotic bodies” release, and phagocytosis during necroptosis. PLoS Biol. 2017 Jun 26;15(6):e2002711. doi: 10.1371/journal.pbio.2002711. PMID: 28650960; PMCID: PMC5501695. 
7. Shutinoski B, Alturki NA, Rijal D, Bertin J, Gough PJ, Schlossmacher MG, Sad S. K45A mutation of RIPK1 results in poor necroptosis and cytokine signaling in macrophages, which impacts inflammatory responses in vivo. Cell Death Differ. 2016 Oct;23(10):1628-37. doi: 10.1038/cdd.2016.51. Epub 2016 Jun 3. PMID: 27258786; PMCID: PMC5041191. 
8. Kelliher MA, Grimm S, Ishida Y, Kuo F, Stanger BZ, Leder P. The death domain kinase RIP mediates the TNF-induced NF-kappaB signal. Immunity. 1998 Mar;8(3):297-303. doi: 10.1016/s1074-7613(00)80535-x. PMID: 9529147. 
9. Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010 Oct;11(10):700-14. doi: 10.1038/nrm2970. Epub 2010 Sep 8. PMID: 20823910. 
10. Cho YS, Challa S, Moquin D, Genga R, Ray TD, Guildford M, Chan FK. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 2009 Jun 12;137(6):1112-23. doi: 10.1016/j.cell.2009.05.037. PMID: 19524513; PMCID: PMC2727676. 
11. Upton JW, Kaiser WJ, Mocarski ES. Virus inhibition of RIP3-dependent necrosis. Cell Host Microbe. 2010 Apr 22;7(4):302-313. doi: 10.1016/j.chom.2010.03.006. PMID: 20413098; PMCID: PMC4279434. 
12. Sun L, Wang H, Wang Z, He S, Chen S, Liao D, Wang L, Yan J, Liu W, Lei X, Wang X. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012 Jan 20;148(1-2):213-27. doi: 10.1016/j.cell.2011.11.031. PMID: 22265413.